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科学家发明基于共价连接适合高通量应用的新型

更新时间: 2019-03-05

目前已知的RNA结合蛋白已经超过一千种,良多从前被认为不结合RNA的蛋白质近期亦被发现存在RNA结合才干,所结合的RNA对调控这些蛋白质机器的活性发挥了重要作用。CLIP是研究体内蛋白质-RNA彼此作用最为提高的措施之一。该方法历经改进,产生了多种变体,但现有CLIP版本均依靠于高特异性的抗体,实验步骤庞杂,通常要采用喷射性同位素标记,所获数据的可重复性差,无奈范畴化应用。因此,研发简洁高效且适合高通量应用的新方法是系统性理解蛋白质-RNA相互作用的关键跟事不宜迟。

该研讨采取一种全新的基于SpyTag-SpyCatcher这一共价交接洽统的纯化策略,极大地进步了所获蛋白质-RNA复合物的纯度。同时对CLIP建库的流程进行创新设计,防止了传统CLIP方法中多步限度范围化操作和大量损耗起始材料的效率制约性步骤。此外,还引入通用的input文库用以背景扣除,进一步提高了CLIP方法的特异性。这些核心改良不仅避免了现有CLIP方式对抗体的依附,提高了数据的信噪比和可反复性,并大幅下降了操作的难度和时长,使得SpyCLIP办法可能适应高通量研究的须要。利用SpyCLIP这一新工具,研究人员在哺乳动物细胞中研究了内含子结合蛋白PTBP1和RBFOX2的结合图谱,发现SpyCLIP可能切实、高效地捕捉它们的剪接调控位点;研究了组蛋白mRNA专一性结合蛋白SLBP,发明SpyCLIP能以极高的特异性捕获其与组蛋白mRNA的互相作用,并发现了新的非组蛋白结合对象;研究了microRNA效应器蛋白AGO2的结合图谱,比较和揭示了3’非翻译区和编码区microRNA靶位点的机制和特色。SpyCLIP对多种RNA联合蛋白均表现出杰出的灵敏度跟特异性,为规模化、体系性研究蛋白质-RNA彼此作用供给了一种简练易用且具备高精度的新工具。

1月31日,国际学术期刊《核酸研究》(Nucleic Acids Research)在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所吴破刚试验室的研究成果:SpyCLIP: an easy-to-use and high-throughput compatible CLIP platform for the characterization of protein-RNA interactions with high accuracy。该研究将SpyTag-SpyCatcher这一共价交联系统翻新性地应用到CLIP技巧中,极大地降落了CLIP技能的难度并先进了所获数据的特异性。研究还对CLIP建库流程进行了从新设计,使之适应于自动化操作和高通量运用的恳求。

吴破刚为论文通讯作者,副研究员赵雅和博士研究生张尧为论文奇特第一作者。该项研究工作得到中科院、基金委和科技部的经费支持。

SpyCLIP为研究细胞内蛋白质-RNA相互作用供应了更为简便、准确的方法